熒光定量PCR檢測故障導(dǎo)航標(biāo)

 　　熒光定量PCR檢測的基本原理就是在PCR擴增過程中，隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增，PCR產(chǎn)物不斷積累，熒光信號也會相應(yīng)的增加，這樣就可以通過熒光強度的變化來對PCR反應(yīng)進行實時的監(jiān)測。實現(xiàn)基因的相對定量、定量和定性分析。熒光定量PCR檢測系統(tǒng)采用熱電制冷器實現(xiàn)金屬模塊變溫，即通過微機自動控制電路去控制熱電制冷器正反向工作，改變變溫金屬模塊的溫度，熒光定量PCR檢測使置于金屬模塊里的試管中的反應(yīng)物達(dá)到PCR的要求。參照圖1，熱循環(huán)單元包括可插放若干個試管的變溫金屬模塊，熱電制冷器，散熱器，風(fēng)扇，熱蓋。風(fēng)扇、散熱器和熱電制冷器依次從兩邊緊貼變溫金屬模塊，由于熱電制冷器采用兩面緊貼的結(jié)構(gòu)，因此熒光定量PCR檢測與普通將熱電制冷器貼在模塊底部的結(jié)構(gòu)比較，單位面積的加熱或制冷功率更大，溫度變化的速度也更高，試管的上方設(shè)有防止試管內(nèi)反應(yīng)物蒸發(fā)的熱蓋。在變溫金屬模塊和熱蓋中分別設(shè)有溫度傳感器，傳感器將溫度信號輸給控制單元。
　　該熒光定量PCR檢測的主要優(yōu)點：
　　1、背景干凈：自主知識產(chǎn)權(quán)的不形成二聚體的引物設(shè)計使PCR反應(yīng)背景干凈。
　　2、靈敏度高：由于采用熒光染料(SYBR Green I )，靈敏度高熒光探針PCR一個數(shù)量級。
　　3、操作簡便：熒光定量PCR檢測逆轉(zhuǎn)錄(RT)-實時熒光擴增(PCR)兩步合并單管反應(yīng)。
　　4、特異性高：由于選取引物序列具有代表性，經(jīng)過多次的實驗，特異性高。
　　5、價格便宜：由于采用熒光染料，價格比TaqMan探針方法低。
　　熒光定量PCR檢測常見故障維修：
　　故障1機器程序運行中出現(xiàn)“PCR．EXE程序出錯”，點擊后程序關(guān)閉，檢測結(jié)果丟失。
　　造成這種故障的原因是232接口不良，熒光定量PCR檢測系統(tǒng)在通訊時對232接口的讀寫出現(xiàn)錯誤，就會出現(xiàn)以上報警。將232接口固定緊或重新焊接即可解決。
　　故障2 無試管狀態(tài)下各孔的熒光值差異增大。這種現(xiàn)象是因為試管孔或熱蓋被污染，這時需要清除試管孔或熱蓋上的污物。清除污物時用毛刷沾少量*清洗模塊上的錐孔及熱蓋，保證熒光定量PCR檢測試管與錐孔壁接觸充分、導(dǎo)熱良好、避免污染。表面如有污跡，還可用軟布沾清潔膏清洗。注意在儀器進行清洗時，必須切斷電源，清洗模塊上的錐孔時嚴(yán)禁將清洗劑滴入孔內(nèi)。
　　故障3個別熒光曲線突然(較大)下降。造成這種故障的原因主要是試管內(nèi)留有氣泡，由于溫度升高后可能會造成氣泡破裂，熒光定量PCR檢測使熒光值突變(降低)，因此處理樣本時要注意離心、振蕩均勻，把離心管放置儀器內(nèi)時要檢查試管內(nèi)是否有氣泡。
　　故障4模塊降溫速度明顯變慢。造成這種現(xiàn)象的原因有通風(fēng)孔被阻塞、連接線松動、風(fēng)機損壞或不運轉(zhuǎn)、溫度傳感器損壞、制冷片損壞。經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)熒光定量PCR檢測不運轉(zhuǎn)，導(dǎo)致散熱效果變差，模塊降溫速度變慢。更換故障風(fēng)機，機器運轉(zhuǎn)正常。
　　故障5熱蓋無法加熱。造成這種現(xiàn)象的原因有接插件松動、熱蓋中溫度傳感器損壞、熱蓋中加熱元件損壞。首先檢查接頭插件是否松動，然后檢測熱蓋中溫度傳感器和熱蓋中加熱元件，經(jīng)測量熱蓋中溫度傳感器損壞，更換后儀器使用正常。
　　熒光定量PCR檢測在靶基因被擴增的同時檢測反應(yīng)物中的熒光信號的強度，而熒光信號的強度與靶基因的濃度是成比例關(guān)系的，通過熒光信號的強度能判斷靶基因的濃度。采用光電倍增管檢測熒光強度。即通過光電倍增管將反應(yīng)物的熒光信號逐一檢測，通過信號的強弱來區(qū)分反應(yīng)物的熒光強度。熒光定量PCR檢測部分中多個濾光片的切換采用了獨立步進電機來實現(xiàn)。長壽命的LED激發(fā)光源發(fā)出激發(fā)光，通過濾光片過濾成特定波長的單色光，再通過透鏡聚焦成平行光照射在二向分色鏡上，二向分色鏡上可以反射波長小于一定值的光，因此激發(fā)光被設(shè)計成可以被二向分色鏡反射的單色光，激發(fā)光被反射通過透鏡聚焦在試管的底部，熒光定量PCR檢測特定波長的激發(fā)光束使試管內(nèi)的反應(yīng)物發(fā)出特定波長的熒光，熒光通過透鏡照射在二向分色鏡上，對于波長大于一定值的光可以穿過二向分色鏡，因此熒光設(shè)計成可以穿過二向分色鏡的波長的光穿過二向分色鏡，再被濾光片過濾成特定波長的單色光，zui后被光電倍增管接收變成電信號傳輸給控制單元。濾光片可以分成多個波長，用于過濾不同波長的熒光。步進電機正反向轉(zhuǎn)動帶動同步帶運動，從而使固定在同步帶上的熒光定量PCR檢測左右移動，使其能逐一檢測各個試管的熒光，同時通過撞擊左右側(cè)面的定位板切換濾光片。
　　熒光定量PCR檢測熱循環(huán)單元置于箱體內(nèi)的上部，熒光檢測單元置于其下部，控制單元位于箱體的后部，它執(zhí)行數(shù)據(jù)處理單元通過信號線傳輸過來的指令信號來控制熱循環(huán)單元和熒光檢測單元按要求工作，同時又將控制熱循環(huán)單元和熒光檢測單元中溫度傳感器和光電倍增管的信號處理成數(shù)字信號通過信號線傳輸給數(shù)據(jù)處理單元，熒光定量PCR檢測數(shù)據(jù)處理單元再將這些信號處理成直觀易懂的曲線或圖表在PC機的顯示屏上顯示出來。