miRNA定量檢測的*

 　　所謂miRNA定量檢測就是對已經獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。miRNA定量檢測的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。
　　選擇適宜的限制性核酸內切酶，消化已知目的DNA和載體，獲得線性DNA，用于重組。根據目的DNA和載體的具體情況，選擇一種或者兩種適當的限制酶切割，分別產生對稱性粘性末端（用一種限制性內切酶進行消化而產生帶有互補突出端）、不對稱粘性末端（用兩種不同的限制性內切酶進行消化而產生帶有非互補突出端）、平端。在miRNA定量檢測時，不對稱相容末端連接，次選對稱性粘性相容性末端連接，由于平末端連接效率較低，通常很少采用。但有時目的片段的末端與載體不匹配 ，一般先將不匹配末端補平，然后再以平末端連接。
　　miRNA定量檢測實驗注意事項
　?。ㄒ唬┒繖z測實驗對照設置
　　為使miRNA定量檢測實驗成功，并能在未獲得目的克隆時，查明實驗失敗的原因，每次實驗應包括相應的對照。其中包括感受態細胞的轉化效率、抗菌素是否有效、連接的效率、未連接質粒的背景、磷酸酶處理的效果等。
　?。ǘ?span style="font-size: 12px;">miRNA定量檢測檢測連接反應的效果的對照實驗
　　為檢測連接反應的效果，線化（單限制性酶切，非磷酸酶處理）質粒需同實驗樣品平行連接。取一部份連接反應液用于轉化，隨后涂布到選擇培養基上。平板上所生長的菌落數，可同相同量、未連接的線化質粒、轉化相同數目的細菌后，涂布在選擇培養基上所生長的菌落數比較。如果連接成功，自連接質粒在平板上的菌落數，miRNA定量檢測會遠遠高于未連接的線化質粒轉化細菌所得的菌落數。如果線化成功，未連接的線化質粒（未連接的質粒背景）所得的菌落數應很低。如miRNA定量檢測連接效率高，則自連質粒所得的菌落數應同用完整質粒轉化細菌所得的菌落數相近。 另一種非定量的方法是將等量的未連接質粒和連接質粒在瓊脂上電泳，連接后的樣品的遷移率會降低。
　?。ㄈ?span style="font-size: 12px;">miRNA定量檢測連接實驗需要優化的實驗指標
　　1、載體和插入片段的摩爾濃度比特別重要，載體:插入片段的摩爾數的變化范圍可為8:1到1:16，但通常的變化范圍是3:1到1:3。插入片段的長度和序列的變化會影響和同一載體的連接效果。每一個連接反應都需要作實驗，來選擇*的載體和插入片段的摩爾數比。在zui小的反應體積中，通常一個連接反應用10~50 ng的載體DNA。
　　2、進行連接反應時的保溫的時間和溫度也需優化。一般而言，平末端連接在22℃保溫4~16小時，粘性末端在22℃保溫3小時，或4℃保溫16小時。大多數連接反應用miRNA定量檢測連接酶，但大腸桿菌的DNA連接酶可用于粘性末端的連接，平末端連接時用此酶，活力較低。每次連接反應用1~10 Weiss單位的高質量連接酶。
　　3、用于轉化連接反應液的細菌菌株，以及用于重組質粒擴增的菌株，需經挑選，細菌生長的溫度也要挑選。當用pGEM載體克隆大片段時（>7~8 kb），經轉化的菌株在30℃而不是在37℃生長，更有利于連接。作簡單的miRNA定量檢測連接實驗，定量檢測轉化效率的感受態細胞就可滿足克隆需要，更高轉化效率的感受態細胞可用于作比較困難的克隆實驗。為提高獲得目的克隆的機會，應用盡可能高轉化效率的感受態細胞（>108克隆/ugDNA）。 篩選重組克隆時，需選擇抗菌素的濃度。
　　不同廠家生產的miRNA定量檢測連接酶反應條件稍有不同，但其產品說明書上均有zui適反應條件，包括對不同末端性質DNA分子連接的miRNA定量檢測連接酶的用量、作用溫度、時間等。同時提供有連接酶緩沖液（10×、5×、2×），其中多已含有要求濃度的ATP，應避免高溫放置和反復凍融使其分解。目的DNA片段制備、回收、純化時，應避免外來DNA污染。連接產物的轉化：miRNA定量檢測細菌細胞經特殊試劑處理后在適當的條件下具有接收外源DNA的能力，因此可將上述連接產物通過熱刺激或電脈沖轉化感受態細胞，當細菌大量增殖的同時，導入的重組DNA也得到增殖。miRNA定量檢測態細胞所用離心管、培養瓶經酸堿處理或使用新的，15 lbf/in2高壓滅菌20min。白色菌落中重組質粒內插入片段是否是目的片段需通過鑒定。