TA克隆對基因技術的新進展

 　　TA克隆是一種以表達為基礎的基因分離技術。它直接用基因組DNA如酵母人工染色體(YACs)捕捉克隆片段，從而達到快速地從大的基因組區域分離表達序列。其主要技術是用PCR擴增來自不同組織的混合TA克隆池或已克隆的克隆文庫，擴增的克隆片段與用生物素隨機標記的基因組目標DNA雜交，捕獲親和素標記磁珠上的與目標DNA雜交的克隆片段，然后洗脫磁缽上捕獲的TA克隆并進行PCR擴增，再進行第二輪篩選，并將篩選出的克隆片段克隆到載體上。
 
　　TA克隆產物克隆方法的新進展,隨著克隆技術的發展和普及，克隆克隆產物已經廣泛的應用于分子生物學的各個領域。通?？寺‘a物不具有粘端，只能進行平端連接的克隆，且由于ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能在兩條ＤＮＡ鏈的３'末端加上一個多余的堿基，致使平端連接的效率不高，克隆效率低。改進的方法一股是在TA克隆引物的５'端加上限制性內切酶識別序列，或是改變引物中ｌ至數個核昔酸引入限制酶位點，然后用相應的酶處理克隆產物即可獲得粘端，通過粘端的連接，可平端連接通常情況下，TA克隆產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能在兩6條DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基，使基因合成的PCR產物成為3'突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。在采用大量T4DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率。對于較短PCR產物，用PUS19的HincⅡ位點進行克隆，以X－gal和IPTG篩選，常可得到足量重組子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將TA克隆產物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆克隆產物。引物決定克隆擴增產物的特異性與長度。因此，引物設計決定PCR反應的成敗。
 
　　TA克隆主要是對基因的染色體上具有一定座位的遺傳單位，是DNA分子中一定長度的核苷酸序列。植物的生長發育是在多種代謝和生理過程基礎上所發生的基因在時空上表達的綜合現象，開發和分離潛在的各種有價值的基因并深入研究其表達機理，對作物品種的改良具有重要意義。因此TA克隆對植物基因的克隆并發展與之相關的技術已引起人們的日益關注和投入，近年來其研究方法不斷改進，新技術不斷涌現，這為進一步研究諸如各種調節植物生長發育的基因、逆境與防御反應的基因、植物細胞凋亡的基因等提供了新的途徑。
 
　　TA克隆的操作一般采用兩步法,即*個循環多以較低的退火溫度進行擴增,后20個循環則采用較高的退火溫度擴增。TA克隆產物多較短,一般需高濃度的瓊脂糖凝膠檢測,也可用聚丙烯酰胺凝膠檢測。如擴增的模板為mRNA,通過比較擴增產物的強度,可以得知該基因在2種生物或同一生物不同發育階段的表達強度。另外,在TA克隆檢測到與某一表型相關的基因或基因產物(mRNA)以后,下一步工作就是克隆出整個基因或mRNA。主要操作程序為:(1)TA克隆產物的提取、克隆及序列測定。首先將克隆檢測到的特定片段從凝膠中切下,提取DNA克隆到適宜的載體內(如TA載體),再測定其核苷酸組成。根據其核苷酸組成設計2個方向相反的引物(P-1,P-2,見圖2)。引物長度多在20 nt以上；退火溫度在60℃以上；(2)將基因組DNA做適當酶切,然后在其兩端連接上相同的接頭根據接頭的序列擴增。